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胸腺素a1抗體的制備及其效價(jià)測(cè)定

【摘要】  目的 制備用于檢測(cè)胸腺素α1基因工程表達(dá)產(chǎn)物的特異性抗體。方法 以提純的胸腺素α1與牛血清白蛋白偶聯(lián)后作為抗原,皮下多點(diǎn)注射免疫大鼠。經(jīng)過3個(gè)月的免疫,獲得抗胸腺素α1的多克隆抗體。結(jié)果 用間接酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）方法,測(cè)定抗體效價(jià)超過5,000,顯示該抗體能與胸腺素α1抗原特異性地產(chǎn)生明顯免疫反應(yīng)。結(jié)論 采用本法制備的抗體具有很好的靈敏性和特異性。為胸腺素α1的分離純化及大規(guī)模，從而為進(jìn)一步滿足臨床需要奠定了基礎(chǔ)。 

【關(guān)鍵詞】  胸腺素α1抗體　酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)

　　胸腺素（Thymosin α1，Tα1）作為一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑（BRM）〔1～4〕,在臨床中具有良好療效，主要治療乙型肝炎〔5，6〕、丙型肝炎〔7〕及多種惡性腫瘤〔8，9〕，也用于艾滋病等免疫缺陷性疾病的治療。制備Tα1特異性的抗體對(duì)于Tα1基因的表達(dá)產(chǎn)物的鑒定至關(guān)重要。本文用大鼠作為免疫動(dòng)物,采用皮下多點(diǎn)免疫注射的方法，獲得了滿意的抗Tα1抗體。

　　1 　 材料與方法

　　11 　材料與試劑                         

　　Tα1購(gòu)自市售成都地奧九泓制藥廠,規(guī)格16 mg/瓶;牛血清白蛋白、*福氏佐劑及不*福氏佐劑、辣根酶標(biāo)記山羊抗大鼠Ig G（H+L）均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司;大鼠,雌性，6～8周齡，225～234 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。

　　12 　 方法

　　121 　制備偶聯(lián)復(fù)合體                         

　　用pH 74的01 mol/L PBS 緩沖液溶解Tα1和BSA,緩慢加入60%、05 mol/L NaCl,使Tα1的終濃度為01 mg/ml,置于振蕩器中輕微振蕩3 h。

　　122 　 制備抗體血清

　　1221 　卡介苗致敏                         

　　在動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)大鼠6只,觀察2 w，其健康狀態(tài)良好后,每只大鼠后足掌皮下注射005 ml卡介苗。

　　1222  　第1次免疫注射                         

　　卡介苗致敏2 w后,以BSATα1偶聯(lián)產(chǎn)物做抗原,與等體積*福氏佐劑充分乳化后,免疫注射。位點(diǎn)在大腿肌肉腹股溝處,每點(diǎn)皮下注射02 ml，陰性對(duì)照注射等量生理鹽水。

　　1223 　第2次免疫注射                         

　　*次免疫注射2 w后,選擇脊椎兩旁各4個(gè)位點(diǎn),腹股溝各1點(diǎn),每點(diǎn)02 ml進(jìn)行皮下免疫注射。

　　1224 　第3次免疫注射                        

　　 2 w后,免疫注射位點(diǎn)在背部脊柱旁各3個(gè),腹股溝及腋下各1點(diǎn),每點(diǎn)02 ml。

　　1225 　加強(qiáng)免疫                         

　　第3次免疫注射后,每隔20～25 d,以不*福氏佐劑與Tα1BSA偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)充分乳化后進(jìn)行背部多點(diǎn)免疫;zui后1次免疫后的第7天采血,4℃冰箱過夜,離心分離血清。用ELISA法測(cè)定其效價(jià),達(dá)到要求后,眼球取血,獲得血清,分裝保存在-20℃冰箱備用。

　　123　抗血清的純化                         

　　用硫酸銨鹽沉淀提純抗體〔10～12〕。

　　1231　鹽析                        

　　 取分離后獲得的血清與等量生理鹽水混合稀釋,于攪拌下逐滴加入等量的飽和硫酸銨,使其終濃度為50%,4℃冰箱過夜,使其充分沉淀。經(jīng)離心后棄去上清，以生理鹽水溶解沉淀。再逐滴加入飽和硫酸銨，使其終濃度為33%，4℃冰箱過夜。重復(fù)用50%及33%的飽和硫酸銨依次提取。將末次離心后所得沉淀物以002 mol/L PBS溶解后裝入透析袋。

　　1232 　除鹽                        

　　 將盛裝鹽析物溶液的透析袋置于大燒杯中，在電磁攪拌下，以蒸餾水和生理鹽水交替透析48 h,此過程每隔3～4 h換液。

　　124 　ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)

　　1241 　 包被                         

　　用pH 96碳酸鹽緩沖液稀釋Tα1至終濃度5 μg/ml,包被酶標(biāo)板，將酶標(biāo)板放入濕盒中，置4℃冰箱過夜。

　　1242  　封閉                         

　　封閉液用pH 74 PBSTween 20，加5%脫脂奶粉。

　　1243  　加一抗                         

　　以pH 74 PBSTween 20奶粉為稀釋液,將免疫后的大鼠陽(yáng)性血清作不同梯度稀釋;陰性對(duì)照用未免疫的大鼠陰性血清。

　　1244  　加酶標(biāo)二抗                         

　　用pH 74 PBSTween 20脫脂奶粉按1∶1 000稀釋酶標(biāo)二抗山羊抗大鼠HRP。

　　1245 　加底物                         

　　加入TMB顯色液,37℃避光顯色15～20 min后,加入2 mol/L H2SO4 終止反應(yīng)。

　　1246 　讀數(shù)                         

　　用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下讀取吸光值。每次操作間采用浸泡式洗滌方法充分洗滌3次，以除去多余的游離反應(yīng)物。

　　13 　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理                       

　　采用SPSS115軟件包處理數(shù)據(jù)。

胸腺素a1抗體的制備及其效價(jià)測(cè)定

　　2　結(jié)果