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Elisa實(shí)驗(yàn)相關(guān)知識(shí)
問：做間接Elisa法測(cè)試小鼠血清中的IgE抗體，設(shè)空白對(duì)照、和陰性對(duì)照、陽性血清稀釋倍數(shù)為5千、1萬、10萬、20萬不等，用的是生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgE抗體，和親和素的辣根過氧化物酶。可是結(jié)果除了空白對(duì)照孔沒有顏色外，其余各孔全有顏色，而且OD值都相差不大，為什么？
回答：可能原因如下：
（1） 水質(zhì)被金屬離子等污染；防止辦法盡量使用新鮮水或蒸餾水。
（2） 洗滌不充分，樣品中其它成分殘留或酶殘留；防止辦法洗滌液應(yīng)注滿微孔，充分洗滌。
（3） 移液頭重復(fù)使用，未洗凈或消毒不*； 防止辦法移液頭一次性使用。
（4） 酶標(biāo)板靈敏度過高。
（5） 一抗顯色時(shí)間的控制等等，關(guān)于ELISA的每一步都要注意才行。
ELISA加樣時(shí)的防錯(cuò)小經(jīng)驗(yàn)
（1）用一張寫滿字的紙，字越多越好，比如報(bào)紙，墊在下面，這樣，加過標(biāo)本的小孔看過去下面的字會(huì)變小，沒加的字正常，非常容易區(qū)分。
（2）可以利用液面反光與沒有加的孔加以區(qū)別
（3）在標(biāo)本加完后，再把加樣槍全壓下，使液面產(chǎn)生小氣泡，也可以加以區(qū)分
棋盤試驗(yàn)的操作方法:
（1）將抗原按一定的梯度倍比稀釋后，按照ELISA從上到下（或者從左到右）的順序包被。
（2）將抗體按一定的梯度倍比稀釋后按照ELISA從左到右或者從上到下加入。
（3）二抗的稀釋倍數(shù)是一定的，然后顯色，讀值。
OD值的測(cè)定時(shí)，波長(zhǎng)要根據(jù)顯色劑的不同而定，一般上大家都使用TMB顯色，450nm讀值。根據(jù)讀值得結(jié)果可以選定合適的抗原和抗體效價(jià)，這就是棋盤 實(shí)驗(yàn)的目的，如果抗原包被量已知而二抗的工作濃度不確定的話就用一抗和二抗作棋盤試驗(yàn)。