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新城疫病毒（NCV）熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒說明書
用途： 新城疫病毒的RT-PCR體外分型檢測(cè)
檢測(cè)原理：試劑盒中含有新城疫病毒基因特異性引物和探針，當(dāng)樣品中含有新城疫病毒時(shí)，提取新城疫病毒RNA通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)成指數(shù)擴(kuò)增，在反應(yīng)過程中新城疫病毒的特異熒光探針跟靶核酸雜交, 同時(shí)被Taq酶水解, 把探針上的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開而產(chǎn)生熒光, 探針采用Fam熒光基團(tuán)標(biāo)記，從而通過其熒光增量來實(shí)時(shí)判斷新城疫病毒的存在。
技術(shù)參數(shù)：1. 符合SN/T 1686-2005《新城疫病毒中強(qiáng)毒株檢測(cè)方法：熒光RT-PCR法》的檢測(cè)要求，可用于禽肉、禽類組織臟器、禽類排泄和分泌物，及其泄殖腔和咽喉拭樣中新城疫病毒的檢測(cè)。
2. 靈敏度：對(duì)于接種的雞胚尿囊液，檢測(cè)的zui高稀釋度可達(dá)10-8～10-7，與雞胚病毒分離方法的靈敏度接近。定量檢測(cè)線性范圍可達(dá)10-1010拷貝/ml。
3. 特異性：采用基因序列數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)，并通過系統(tǒng)驗(yàn)證，新城疫病毒RT-PCR能夠檢測(cè)所有已知新城疫病毒毒株。對(duì)于其它禽類感染因子，本試劑盒檢測(cè)結(jié)果為陰性。
產(chǎn)品盒組成：（不包括新城疫病毒RNA提取試劑,用戶可采用通用型病毒RNA提取試劑盒或試劑盒推薦的提取方法。）
適用儀器：ABI7500，9600系列，MJ opticon2，Bio-Rad等熒光定量PCR儀均可。
實(shí)驗(yàn)方法：1. 用戶可采用通用型病毒RNA提取試劑盒提取新城疫病毒RNA用于檢測(cè)或保存于-20℃以待檢測(cè)。
2. 將RT-PCR一步法反應(yīng)液置室溫平衡，融化后取Taq HS酶和逆轉(zhuǎn)錄酶（使用前2000rpm離心10sec），按2.5U/管加入Taq HS酶，5.0U/管加入逆轉(zhuǎn)錄酶，即每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制為： RT-PCR反應(yīng)液18.5ul+0.5ul Taq HS酶+1ul逆轉(zhuǎn)錄酶。
3. 加入模板：若樣本提取物保存在-20℃，則在使用前置室溫解凍；陰、陽性對(duì)照使用前置室溫解凍。在每個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入模板或陰、陽性對(duì)照各5μl，蓋好管蓋，置于PCR儀上，記錄相應(yīng)的樣品號(hào)。
4. 循環(huán)條件設(shè)置：
熒光RT-PCR的反應(yīng)參數(shù)為：
—— *階段，反轉(zhuǎn)錄 50℃/30 min；
—— 第二階段，預(yù)變性 94℃/2 min；
—— 第三階段，94℃/5 s，60℃/40 s，40 個(gè)循環(huán)，熒光收集設(shè)置在第三階段每次循環(huán)的退火延伸區(qū)。信號(hào)采集設(shè)為Fam熒光素。反應(yīng)體系設(shè)為25μl。
結(jié)果分析：對(duì)于MJ Opticon2系列熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行結(jié)果分析時(shí)，扣除本底后再輸入1-15之間的熒光值，進(jìn)行Ct值的設(shè)置或拖動(dòng)基線到合適的位置以確定ct值。
對(duì)于ABI7500，9600系列熒光PCR檢測(cè)儀進(jìn)行結(jié)果分析時(shí)基線的確定：取3-10或3-15個(gè)循環(huán)的熒光值，閾值設(shè)定原則為閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的zui高點(diǎn)，而不顯示Ct值為宜。
質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：陰性對(duì)照無Ct值顯示或Ct值為40，陽性對(duì)照的Ct值≤30.0，否則為實(shí)驗(yàn)失敗。
結(jié)果判斷：1. 檢測(cè)樣本Ct值≤35.0時(shí)，報(bào)告陽性。
2.檢測(cè)樣本Ct值>35.0且Ct值<40時(shí)，需重復(fù)檢測(cè)一次，如果Ct值仍<40，但曲線有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)特性，報(bào)告本陽性，否則報(bào)告陰性。
3.樣本不顯示Ct值時(shí)，報(bào)告陰性。
試劑盒使用注意事項(xiàng)：1. 本試劑盒僅用于體外檢測(cè)等研究用途，開始使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說明書全文。
2.實(shí)驗(yàn)必須嚴(yán)格分區(qū)操作：PCR前準(zhǔn)備區(qū)——準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)試劑；樣本處理區(qū)——待測(cè)樣本、模板處理區(qū)；檢測(cè)區(qū)——PCR擴(kuò)增檢測(cè)。
3.所用的吸頭和離心管都需要經(jīng)DEPC水處理，以滅活RNA酶，75%乙醇也要用DEPC處理過的水配制。
4.試劑盒中各試劑充分融化后請(qǐng)短暫離心。反應(yīng)液分裝時(shí)應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡。上機(jī)前應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免污染儀器。
5.有關(guān)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范請(qǐng)參照國(guó)家相關(guān)部門頒布的基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。