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| 干擾素生物學(xué)活性測定法 |
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| 點擊次數(shù)：1449 更新時間：2011-08-23 |
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本法系依據(jù)干擾素可以保護人羊膜細胞（WISH）免受水泡性口炎病毒（VSV）破壞的作用，用結(jié)晶紫對存活的WISH細胞染色，于波長570nm處測定其吸光度，可得到干擾素對WISH細胞的保護效應(yīng)曲線，以此測定干擾素生物學(xué)活性。
試劑 （1）MEM或RPMI 1640 培養(yǎng)液取MEM或RPMI 1640 培養(yǎng)基粉末1袋（規(guī)格為1L），加水溶解并稀釋至1000ml，加青霉素105IU和鏈霉素105IU，再加碳酸氫鈉2.1g，溶解后，混勻，除菌過濾，4℃保存。
（2）*培養(yǎng)液量取新生牛血清10ml，加MEM或RPMI 1640培養(yǎng)液90ml。4℃保存。
（3）測定培養(yǎng)液量取新生牛血清7ml，加MEM或RPMI 1640培養(yǎng)液93ml。4℃保存。
（4）攻毒培養(yǎng)液量取新生牛血清3ml，加MEM或RPMI 1640培養(yǎng)液97ml。4℃保存。
（5）消化液取乙二胺四乙酸二鈉0.2g、氯化鈉8.0g、氯化鉀０.2g、磷酸氫二鈉1.152g、磷酸二氫鉀0.2g，加水溶解并稀釋至1000ml，經(jīng)121℃ 15分鐘滅菌。
（6）染色液取結(jié)晶紫50mg，加無水乙醇20ml溶解后，加水稀釋至100ml，即得。
（7）脫色液取無水乙醇50ml、乙酸0.1ml，加水稀釋至100ml。
（8）PBS取氯化鈉8.0g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g，加水溶解并稀釋至1000ml，經(jīng)121℃ 15分鐘滅菌。
標準品溶液的制備 取人干擾素生物學(xué)活性測定的品，按說明書復(fù)溶后，用測定培養(yǎng)液稀釋至每1ml含1000IU。在96孔細胞培養(yǎng)板中，做4倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2孔。在無菌條件下操作。
供試品溶液的制備 將供試品按標示量溶解后，用測定培養(yǎng)液稀釋成每1ml約含1000IU。在96孔細胞培養(yǎng)板中，做4倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2個孔。在無菌條件下操作。
測定法 使WISH細胞在培養(yǎng)基中貼壁生長。按1︰2～1︰4傳代，每周2～3次，于*培養(yǎng)液中生長。取培養(yǎng)的細胞棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2次后消化和收集細胞，用*培養(yǎng)液配制成每1ml 含2.5×105～3.5×105個細胞的細胞懸液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)4～6小時。將配制完成的標準品溶液和供試品溶液移入接種WISH細胞的培養(yǎng)板中，每孔加入100μl。于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)18～24小時。棄去細胞培養(yǎng)板中的上清液。將保存的水泡性口炎病毒（VSV，－70℃保存）用攻毒培養(yǎng)液稀釋至約100CCID50，每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)24小時（鏡檢標準品溶液的50%病變點在1IU/ml）。然后棄去細胞培養(yǎng)板中的上清液，每孔加入染色液50μl，室溫放置30分鐘后，用流水小心沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液100μl，室溫放置3～5分鐘?；靹蚝?，用酶標儀以630nm為參比波長，在波長570nm處測定吸光度，記錄測定結(jié)果。
試驗數(shù)據(jù)采用計算機程序或四參數(shù)回歸計算法進行處理。并按下式計算試驗結(jié)果 供試品生物學(xué)活性（IU/ml）=Pr×Ds×Es
Dr×Er
式中Pr為標準品生物學(xué)活性，IU/ml；
Ds為供試品預(yù)稀釋倍數(shù)；
Dr為標準品預(yù)稀釋倍數(shù)；
Es為供試品相當于標準品半效量的稀釋倍數(shù)；
Er為標準品半效稀釋倍數(shù)。
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