一站式非變性PAGE電泳套裝
產(chǎn)品及特點(diǎn)非變性PAGE電泳是研究SSCP-PCR（single-strand conformation polymorphism-PCR、單鏈PCR片段構(gòu)象多態(tài)性）和凝膠滯阻（Gel Shift）的重要研究手段，因?yàn)樵诜亲冃訮AGE中， DNA的遷移率除跟長(zhǎng)短相關(guān)外，還跟其構(gòu)象和結(jié)合的蛋白質(zhì)相關(guān)。本產(chǎn)品就是專(zhuān)門(mén)用于非變性PAGE的試劑，它具有下列特點(diǎn):
1.一站式，用戶(hù)只需要準(zhǔn)備水和樣品，十分方便。
2.安全，免去了實(shí)驗(yàn)人員接觸粉末狀的劇毒物品丙烯酰胺。
3.靈活，提供的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺便于用戶(hù)配制各種交聯(lián)度的PAGE膠，用于各種不同實(shí)驗(yàn)。
4.PAGE電泳后可直接用于銀染等后續(xù)試驗(yàn)。
規(guī)格及成分成份30次大紙盒包裝
丙烯酰胺干粉（CAT#:100876-60）60 g
甲叉雙丙烯酰胺干粉（CAT#:100877-3）3 g
TEMED（CAT#:100880-1.5）1.5 mL
過(guò)硫酸銨干粉（CAT#:100879-1）1 g
DNA非變性PAGE上樣液，2×（CAT#100875-1.5）1 mL
TBE電泳液，10×（CAT#:90313）250 mL
使用手冊(cè)1份
運(yùn)輸及保存常溫運(yùn)輸，保存條件見(jiàn)上表，有效期一年。
自備試劑去離子水
使用方法下面以SSCP-PCR為例說(shuō)明DNA非變性PAGE電泳濃度和交聯(lián)度的選擇，非SSCP-PCR實(shí)驗(yàn)需要自行摸索相關(guān)參數(shù)。
一、PAGE濃度的選擇：使用濃度為5-12%的丙烯酰胺膠，因?yàn)镾SCP-PCR的擴(kuò)增長(zhǎng)度一般在150-200 bp之間，而5%的PAGE的有效分辨范圍為80-500bp、8%的PAGE的有效分辨范圍為60-400bp、12%的PAGE的有效分辨范圍為40-200bp。
二、PAGE交聯(lián)度的選擇：交聯(lián)度越低，孔徑越大，對(duì)DNA分子構(gòu)象的變化越靈敏，SSCP分辨率越高，但過(guò)低則膠太軟，不好進(jìn)行電泳后的后續(xù)操作，所以一般選擇1-2%的交聯(lián)度（即丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺在49:1到48:2之間）。
三、體積的選擇：SSCP-PCR檢測(cè)需要長(zhǎng)約30-40 cm的測(cè)序膠板，可以結(jié)合梳子的厚度，計(jì)算膠的體積。
操作：
1.*次使用本產(chǎn)品時(shí)需先配制30%丙烯酰胺溶液:在本產(chǎn)品提供的裝有60克丙烯酰胺干粉的塑料瓶中加入146 mL自備的去離子水，充分搖晃直到溶解即得200 mL 30%丙烯酰胺溶液（用手大約搖10-20分鐘）。
2.*次使用本產(chǎn)品時(shí)還需配制一定交聯(lián)度的30%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液: 不同實(shí)驗(yàn)需要加入不同比例的甲叉雙丙烯酰胺。對(duì)一般分離實(shí)驗(yàn)，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺比例一般在19:1左右，因?yàn)榇藭r(shí)PAGE膠的孔徑zui小，分辨率zui高。制備方法是將3g甲叉雙丙烯酰胺干粉加入到200 mL上步配好的30%丙烯酰胺溶液中。對(duì)檢測(cè)DNA空間構(gòu)型的PAGE膠（如SSCP-PCR產(chǎn)物）如果需要配制的交聯(lián)度是49：1，則加入的甲叉雙丙烯酰胺的量是丙烯酰胺的量（60 g）的49分之1。配好的30%ＡＢ溶液4℃避光保存并在１月內(nèi)用完。
3.配制PAGE膠（這是配制100 mL膠的用量，配制更大體積的膠則需以此用量為基礎(chǔ)按比例增加）。在一個(gè)250mL的三角瓶中，先按下表的用量加入去離子水、40%丙烯酰胺溶液和10×TBE緩沖液。丙烯酰胺單體溶液具有神經(jīng)毒性，一定要戴手套操作。
PAGE
膠濃度各成分用量（單位：mL）總體積
（mL）
去離子水30%丙烯酰胺10×TBE
緩沖液
5%73.316.710.0100
6%70.020.010.0100
7%66.723.310.010.00
8%63.326.710.0100
9%60.030.010.0100
10%56.733.310.0100
11%53.336.710.0100
12%50.040.010.0100
注：有大量文獻(xiàn)報(bào)道PAGE膠中加入5%-10%的甘油能提高某些SSCP-PCR產(chǎn)物的分辨率。如果選擇加入10%的甘油，則減少去離子水的用量10mL，同時(shí)加入10 mL甘油。
C：搖晃混勻。能抽真空10-15分鐘以去除溶液中的氧氣（氧氣能抑制丙烯酰胺聚合反應(yīng)），無(wú)條件也可以不脫氧。
D：加入500 uL 10%APS和100 uL TEMED，迅速搖勻后倒膠。
E: 在膠的液面距離達(dá)到頂部時(shí)停止灌膠，插入梳子。
F: 室溫聚合30-60分鐘（低溫抑制聚合反應(yīng)）。
G: 拔出梳子，用1×TEB液沖洗加樣孔。
H: 放4℃冰箱預(yù)冷30分鐘-12小時(shí)。為了防止膠收縮，頂部加少量1×TBE緩沖液。預(yù)冷的膠有利于保持單鏈DNA的構(gòu)型。
4.將預(yù)冷的凝膠板固定在電泳裝置上，往上槽和下槽中加入足夠1×TEB電泳液。
5.取3-5 uL SSCP-PCR樣品，加入等體積2×非變性PAGE上樣液，85℃處理5分鐘后冰浴。用前短暫離心后取2 uL上樣。
6.連接電源線，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)。如果PAGE中不含甘油，則使用25W的功率，電泳5-7小時(shí)（對(duì)3-40cm長(zhǎng)的PAGE膠而言）。如果使用含甘油的PAGE，則使用8W的功率，電泳16-18小時(shí)。由于溫度變化過(guò)大會(huì)改變DNA構(gòu)型，所以電泳時(shí)能保持恒溫。對(duì)不含甘油的PAGE，恒溫在4℃、對(duì)含甘油的PAGE，恒溫在25℃。
7.終止電泳，取出凝膠進(jìn)行后續(xù)的處理（如銀染）。
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