細(xì)菌RNAout
產(chǎn)品及特點(diǎn) 本產(chǎn)品是在天凈沙動(dòng)物RNAout基礎(chǔ)上根據(jù)細(xì)菌提取的具體情況改良而得。它基于異硫氰酸胍/酚/提取RNA原理,可用于包括E.coli、Bacillus subtilis和Staphylococcus aureus等各種常見的革氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌。
1． 操作簡(jiǎn)單快速，只要十分鐘左右,可以全在室溫下進(jìn)行。
2． 所得RNA質(zhì)量高,OD260/OD280一般在1.9，不含基因DNA污染。
3． 靈敏度高，可以從一個(gè)菌落中提取到普通電泳能夠檢測(cè)到的總RNA。
4． 性價(jià)比高于進(jìn)口同類產(chǎn)品。
規(guī)格及成分 成份 100次包裝 250次包裝
細(xì)菌RNAout 100 mL 250 mL
使用手冊(cè) 1份 1份
運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸，4℃保存，有效期一年。
自備試劑 ，異丙醇，75%乙醇，RNA溶解液
使用方法 1 在1.5 mL塑料離心管中離心收集0.2-1.5 mL新鮮細(xì)菌（注意:由于細(xì)菌RNA半衰期十分短，所以，必須使用鮮細(xì)菌），吸盡液體培養(yǎng)基，加入1 mL細(xì)菌RNAOUT并用槍充分吹打，確保細(xì)菌全部裂解，沒有塊狀物。如果使用菌落，則用接種環(huán)小心將其轉(zhuǎn)移到裝有1 mL細(xì)菌RNAOUT的1.5 m塑料離心管中，用移液槍吹打均勻。在細(xì)菌數(shù)較少時(shí)，建議使用天澤基因的助沉劑RNADOWN以提高RNA回收率。
2 加入0.2 mL，在振蕩器上充分振蕩混均30秒（必須將管底的液體振蕩起來(lái)，否則不能有效將DNA打斷和去除蛋白質(zhì)）。
3 12000-15000 g室溫離心3分鐘。上清液無(wú)色，下層液呈籃色，中間為蛋白質(zhì)。小心將上清液轉(zhuǎn)移到另一干凈1.5 m塑料離心管中，上清液體積約為0.6 mL。為避免觸及中間層的DNA和蛋白質(zhì)，建議分小量多次吸取，并且只取0.5 mL，留0.1 mL左右。當(dāng)細(xì)菌數(shù)量較少時(shí)，中間層十分松散，上清時(shí)很容易吸到下層有機(jī)相，需要更加小心。
4 在上清液中加入等體積的異丙醇，振蕩器上振蕩混均30秒。
5 12000-15000室溫離心3-10分鐘，RNA將在管底側(cè)面形成沉淀。
6 小心吸棄上清液，注意不要吸棄RNA沉淀。
7 在離心管中加入1mL 75%乙醇，振蕩器上振蕩混均30秒。
8 12000-15000 g室溫離心1分鐘。
9 小心吸棄上清液，注意不要吸棄RNA沉淀。
10 重復(fù)第8到第10步一次。
11 短暫快速離心，用移液槍小心吸棄殘留液（約50 uL）。
12 短暫放1-2分鐘后加入適量RNA溶解液使RNA沉淀溶解，可以立即使用或存放于-80℃長(zhǎng)期保存。
13 RNA完整性的電泳檢測(cè)：
如果需要做Northern雜交，強(qiáng)烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行RNA電泳，因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。如果是簡(jiǎn)單檢測(cè)，可以使用TAE或天澤基因的SuperBuffer-2 DNA/RNA兩用快速電泳液，但文獻(xiàn)報(bào)道必須使用變性上樣液（BioTechniques，9：558，1990）。普通DNA上樣液不含變性劑，也沒經(jīng)過(guò)去RNase處理，所以不要使用。
尤其需要注意的是不要使用TBE進(jìn)行RNA電泳，因?yàn)門BE所含硼酸是研究多糖的經(jīng)典方法----硼酸絡(luò)合法中的關(guān)鍵成分，硼酸通過(guò)與RNA核糖中的羥基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成RNA分子內(nèi)或RNA分子間的絡(luò)合復(fù)合物，使同樣長(zhǎng)度的RNA具有不同的泳動(dòng)速度，電泳條帶彌散，同時(shí)有大的RNA絡(luò)合復(fù)合物遲留在加樣孔中（一般會(huì)誤以為是基因組DNA污染）。RNA分子內(nèi)或RNA分子間的絡(luò)合物的形成的多少和比例又與硼酸與RNA的數(shù)量比例有關(guān)，而RNA樣品中污染的其他多糖（如植物中提取的RNA）也會(huì)參與此反應(yīng)，使硼酸對(duì)RNA電泳的影響更復(fù)雜，所以TBE對(duì)RNA電泳的影響沒有規(guī)律性和重復(fù)性。有的樣品可以使用有的又不行，是避免使用。
由于細(xì)菌細(xì)胞中70-80%的RNA為rRNA，后者又由23S （約3700 nt），16S （約1700 nt）和5S （約100 nt）三種組成，所以變性膠電泳后應(yīng)該在UV下看見三條清晰的rRNA帶。由于核酸長(zhǎng)度與結(jié)合EB的數(shù)量成正比（當(dāng)然還與RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，雙鏈部分結(jié)合能力比單鏈部分強(qiáng)），所以23S rRNA條帶的熒光強(qiáng)度一般比16S rRNA條帶的熒光強(qiáng)度強(qiáng)2倍。如果這兩條rRNA帶不清晰或比例小于此范圍則表示RNA有降解（因?yàn)榇蟮腞NA被酶降解的可能更大）。
14 RNA產(chǎn)量產(chǎn)率測(cè)定：
將5-10 μL RNA溶于TE緩沖液中（pH7.5-8.2之間）檢測(cè)其在OD260的光吸收。通過(guò)光吸收可以得出RNA濃度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），進(jìn)而計(jì)算出RNA的產(chǎn)量和產(chǎn)率。
注意不要將RNA稀釋在DEPC水中檢測(cè)OD260和OD280，否則光吸收比在TE中測(cè)得的低10%-15%，因?yàn)楹怂峁馕崭芤簆H相關(guān)，而DEPC水中的DEPC高壓分解后產(chǎn)生的CO2 與水反應(yīng)生成碳酸，使溶液pH降低進(jìn)而降低RNA的光吸收。
15 RNA純度測(cè)定：
無(wú)污染的總RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之間（具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān)），OD260/OD230一般在2.0-2.3之間，如果低于或高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)或多糖的污染，但一般不影響RT-PCR等反應(yīng)。蛋白質(zhì)污染可以通過(guò)酚/抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA和多糖污染可以分別用天澤基因的DNA Erasol 和PS Erasol去除。
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